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无菌外植体的建立
外植体的选择与灭菌是植物组培快繁中的重要环节，它由原培养材料、灭菌剂、灭菌方法等因素决定，寻找快速、高效的灭菌方法，减少污染瓶的丢弃，对于降低成本具有重要的意义。 1、方法对成功率的影响 大量的试验证明，0.1%的升汞是最理想的杀菌剂，但灭菌时间要求极为严格。时间过短，杀菌不彻底，时间过长，会对组织细胞有杀伤作用，不利于外植体诱导分化。在杀菌方式的比较试验中看出，不同的清洗方式对外植体的杀伤率和成活率影响极大，通过磁棒搅动冲洗能够加大对升汞残留的冲洗，减少对材料的杀伤作用，降低褐化率，提高成功率。 2、外植体的幼嫩程度、灭菌条件对其成活率的影响 外植体的幼嫩程度不同，其含菌量也不同，所需的灭菌条件也有差异。从酒精浓度、0.1%升汞灭菌时间两个方面进行试验，结果表明：幼嫩的外植体材料（如幼叶、幼芽、幼茎段）幼嫩的材料比老材料带菌量少，不仅所需0.1%的升汞的灭菌时间短，在7-9分钟之间能达到灭菌效果，而且酒精可用50%来代替70%，酒精浓度的降低，可以减少对材料的伤害，不降低其粘着效能，有利于升汞的杀菌作用，提高外植体的成活率。老的材料（如半木质化、木质化的茎段）茎段内生菌较多，皮部粗糙，所需0.1%升汞灭菌的时间就长（在9-12分钟之间），且必需用70%的酒精，才能起到较好的灭菌效果。根据不同接种材料，采用不同的措施，就会减少不必要的失败和投资经费，提高成功率。 3、不同品种外植体及取材季节对成活率的影响 在接种外植体时，有的材料易发生褐变现象，它的产生可分为两种形式：一种是由于细胞受胁迫条件等不利条件影响所造成的死亡或自然发生的细胞死亡而引起的；另一种是材料伤口处分泌出的酚类化合物引起的，前者可以通过采取适当的措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生褐变，而后者很难清除，严重影响外植体的诱导分化。只有选择合理的外植体，才能降低褐变现象，大部分易褐变的材料，从11月份到第二年2月份褐变率很低，随着进入生长季节，褐变率逐渐上升，在5、6、7、8月份达到最高峰，然后自9月份后褐变率逐渐下降直到不再发生，为此对易褐变的外植体应在11月到2月取材，通过培养箱内水培催芽取幼嫩部分，或待接种材料放入温室内，保持半木质化，可获得理想的原始培养材料。 外植体所带菌的种类、数量与材料种类和取材季节有关，同时，材料成活率的高低与材料取材的时间及材料本身特性也有关。试验表明，上年11月份到下年4月份取材最好，4月份到6月份与9月份到11月份取材较好，6月份到9月份较差。试验中污染若以细菌为主则成功率高,如平邑甜茶、月季、樱桃、杨树等；以真菌为主则成功率低，如冬枣、花椒、茶树等；一品红由于本身分泌白色乳状物，灭菌较困难成功率亦较低。因此选择适宜的基因型材料，适时接种，可大大提高成功率，减少投资损失。
编辑：Aggie |
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